1、化學(xué)鍵合相填料在高效液相色譜法中占有極重要的地位。它可以鍵合極性較大的有機(jī)基團(tuán)，采用極性較小的溶劑作流動(dòng)相。亦可鍵合極性較小的有機(jī)基團(tuán)，選用極性較大的溶劑作流動(dòng)相。c18 色譜柱是以硅烷化鍵合型(Si-O-Si-C)存在的，這類鍵合反應(yīng)目前應(yīng)用Zui為普遍。

　　

　　2、顆粒度是指柱填料的顆粒直徑的大小。實(shí)際上色譜柱上所標(biāo)的粒徑是一個(gè)平均值。如粒徑“5μm”并不是柱中填料所有的顆粒直徑都是5μm，實(shí)際上有一個(gè)顆粒分布度。這種分布度對(duì)柱反壓及柱效有重要作用。一般來(lái)說(shuō)，平均顆粒度越小，顆粒分布度越小，色譜柱效越高，反壓亦越高。目前c18 柱填料粒徑在4～10μm之間。

　　

　　3、碳含量即填料中的含碳量。傳統(tǒng)的測(cè)量技術(shù)是將填料加熱到碳?xì)滏I斷裂，然后通過(guò)測(cè)定損失的重量或形成的二氧化碳來(lái)計(jì)算碳含量?？梢酝ㄟ^(guò)增加碳鍵的長(zhǎng)度或增加鍵合密度來(lái)增加碳含量。碳含量增加，柱子的保留值增加。鍵合相的色譜行為與鍵合密度有關(guān)，也與硅膠的密度及填料的表面積有關(guān)，填料的密度越高，填柱所需的硅膠量越多，柱子的含碳量也越高。如果用2種不同密度相同碳含量的填料填充柱子，其保留行為將明顯不同。因此，單獨(dú)以碳含量來(lái)預(yù)測(cè)色譜行為是不夠的。

　　

　　4、孔徑是指填料顆粒間的孔間隙。一般所說(shuō)的孔徑是指填料的平均孔徑。球形填料裝柱后平均孔徑分布比較窄，柱床結(jié)構(gòu)均勻，柱效高，重現(xiàn)性好；無(wú)定形填料平均孔徑分布較寬，柱床結(jié)構(gòu)不均勻，流動(dòng)相線性速度不均勻，譜帶擴(kuò)寬。平均孔徑的大小對(duì)分離大分子化合物有較大的影響，在分離含有較大分子的樣品時(shí)可能會(huì)有分子排阻效應(yīng)，或產(chǎn)生吸附效應(yīng)從而影響定量的回收率及準(zhǔn)確度。因而在用反相色譜分離諸如蛋白或多肽樣品時(shí)應(yīng)考慮選用大孔徑(如30 nm)的反相柱填料?？左w積作為硅膠多孔性的參數(shù)，在分離分析較大分子化合物時(shí)可作參考，選用較大孔體積的反相柱填料。

　　

　　5、c18 硅烷化試劑是一個(gè)大于2 nm大分子，因此會(huì)與已鍵合在相鄰的硅醇基上的c18 硅烷化試劑產(chǎn)生嚴(yán)重的立體位阻。其結(jié)果導(dǎo)致在硅膠表面有大量的殘留硅醇基沒(méi)有與硅烷化試劑反應(yīng)，這些極性的硅醇基在一定色譜條件下會(huì)與堿性化合物相互作用引起峰形拖尾，從而可影響定量分析結(jié)果。這些問(wèn)題在一定程度上可以通過(guò)烷基化處理加以克服。烷基化處理是在鍵合相上完成的獨(dú)立反應(yīng)，以減少在硅膠表面的硅醇基。烷基化處理采用小分子(如*硅烷)的試劑，其空間位阻遠(yuǎn)小于c18 基團(tuán)。大多數(shù)固定相僅有30%可覆蓋的鍵合位置。據(jù)報(bào)道，通過(guò)某些極活躍的化學(xué)試劑及特殊的反應(yīng)條件，Zui高的覆蓋量可達(dá)50%。很好地了解硅膠鍵合相的物理特性將有助于在高效液相色譜的反應(yīng)中選擇合適的色譜柱。表面上看c18 柱雖然化學(xué)官能團(tuán)相同，而實(shí)際上不同品牌的C18柱性能可能有很大差別，從而產(chǎn)生不同的分離結(jié)果。